Johanna wurde in der Stadt Toledo, der Hauptstadt des Königreichs Kastilien, geboren. Sie war das dritte Kind und die zweite Tochter von Isabella I. von Kastilien und Ferdinand II. von Aragon aus dem königlichen Haus Trastámara. Sie wurde ausgebildet und erzogen für eine bedeutende Ehe, die - als Allianz zwischen Königsfamilien - die Macht und Sicherheit des Königreiches verbessern sowie dessen Einfluss und friedliche Beziehungen mit anderen Herrschern erweitern würde. Als Infantin konnte sie nicht erwarten, Erbin des Throns von Kastilien oder Aragon zu werden. Durch Todesfälle erbte sie später jedoch beide.
Im Jahre 1496 wurde Johanna im Alter von sechzehn Jahren mit Philipp dem Schönen, Herzog von Burgund, in Flandern in den Niederlanden verlobt. Die Ehe war eine von einer Reihe von Allianzen zwischen den Familien der Habsburger und des Hauses Trastámara, um beide gegen die wachsende Macht Frankreichs zu stärken. Johannas Leben mit Philipp verlief äußerst unglücklich durch seine Untreue und ihre politische Unerfahrenheit. Er versuchte konsequent, ihre gesetzlichen Geburtsrechte auf die Macht an sich zu reißen. Dies führte zu einem nicht geringen Teil zu Gerüchten über ihrem Wahnsinn, geschürt durch Berichte über ihr depressives oder neurotische Verhalten, während sie inhaftiert war oder von ihrem Ehemann manipuliert wurde.
Der Tod von Johannas Bruder, Johannes, die Totgeburt von Johannes Tochter und der Tod der älteren Schwester Isabella und deren Sohn Miguel machten Johanna zur Erbin der spanischen Königreiche. Im Jahre 1502 erkannte der kastilische Cortes von Toro Johanna als Erbin des kastilischen Throns und Philipp als ihren Prinzgemahl an. Nach dem Tod ihrer Mutter im November 1504 wurde Johanna regierende Königin von Kastilien. Johannas Vater, Ferdinand II., verlor seinen monarchischen Status in Kastilien, obwohl seine Frau ihm erlaubte, in Johannas Abwesenheit zu regieren oder falls Johanna nicht bereit war, selbst solange zu regieren, bis Johannas Erbe das Alter von 20 Jahren erreichen würde. Ferdinand weigerte sich, dies zu akzeptieren: Er überzeugte den Cortes, dass Johannas Krankheit so schlimm sei, „dass die Königin Doña Johanna unsere Herrin nicht regierungsfähig sei". Der Cortes ernannte dann Ferdinand zu Johannas Vormund und zum Administrator und Gouverneur des Königreichs. 1506 unterzeichneten Philipp und Ferdinand einen Vertrag, in dem sie feststellten, dass die psychische Instabilität von Johanna sie unfähig zum Regieren machte, und sich gegenseitig versprachen, sie vom Regieren auszuschließen..
Am 25. September 1506 verstarb Philipp in der Stadt Burgos in Kastilien unerwartet an Typhus. Einige vermuteten, dass er von seinem Schwiegervater Ferdinand II. vergiftet wurde, der ihn wegen seiner ausländischen Herkunft aus dem Hause Habsburg nicht besonders liebte und mit dem er nie die Macht teilen wollte. Ferdinand zwang daraufhin Johanna, ihm die Regierung über das Königreich von Kastilien und León zu übertragen. Er sperrte Johanna im Kloster Santa Clara in Tordesillas, in der Nähe von Valladolid in Kastilien, im Februar 1509 ein, nachdem er alle ihre treuen Diener entlassen hatte und ihr nur ein kleines Gefolge lies, das nur ihm allein unterstand. Aus dieser Zeit gibt es einige Berichte, in denen behauptet wurde, dass sie verrückt oder "wahnsinnig" sei, und dass sie die Leiche ihres Mannes mit nach Tordesillas genommen habe, damit er in ihrer Nähe sei.
Im Jahre 1517 gelangte ihr eigener Sohn, Karl I., zu Herrschaft und Thron, indem er seine Mutter für den Rest ihres Lebens im Kloster Santa Clara in Tordesillas, Kastilien, einsperrte. Der Zustand Johannas verschlechterte sich immer weiter. Sie war offensichtlich davon überzeugt, dass einige der Nonnen des Klosters die Absicht hätten, sie zu töten, eine Befürchtung, die nie bewiesen wurde. Angeblich war es schwierig für sie, zu essen, zu schlafen, zu baden oder ihre Kleidung zu wechseln. Karl schrieb an den Kastellan des Klosters von Santa Clara: "Es scheint mir, dass es am besten für Sie ist, sicherzustellen, dass keine Person mit Ihrer Majestät spricht, denn daraus kann nichts gutes kommen".
Johanna starb am Karfreitag, 12. April 1555, im Alter von 75 Jahren im Kloster von Santa Clara in Tordesillas.
